WB 實(shí)驗步驟

一、樣本制備

1、細胞收集

1.1、貼壁培養細胞收集：去除貼壁細胞的培養液，用預冷 PBS 清洗細胞 2 次，吸出 PBS。

1.2、懸浮培養細胞收集：先 3000 轉/min 離心 5 分鐘收集細胞沉淀，再用預冷 PBS 輕輕吹打重懸，離心收集細胞沉淀。

1.3、組織樣本收集：用干凈的醫用剪剪碎目標組織，使組織塊盡量小，此操作最好在冰上進(jìn)行，并且應盡快完成，以防止樣品被蛋白酶降解。將組織用液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min，迅速用液氮研磨，研磨過(guò)程盡量控制在 1-2min 之內，以減少蛋白的降解。

2、總蛋白提取

2.1、細胞/組織裂解：對于細胞樣本，加入預冷的 RIPA 裂解緩沖液(含有 PMSF)（每 107 細胞/100 mm 培養皿/150cm2 培養瓶加入 1ml；每 5×106 細胞/60 mm 培養皿/75cm2 培養瓶加 0.5ml），冰上裂解 15min。

對于組織樣本，按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，多次勻漿，直至組織完全勻漿，收集勻漿液。（裂解液中根據需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑）。

2.2、離心

把裂解好的樣本置于于預冷的高速冷凍離心機中，12000rpm，10min。

2.3、蛋白變性

離心完成后，棄去沉淀，保存上清。吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度（BCA 法）測定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加 5×Loading Buffer（最終工作液為 1X)，95℃加熱變性 5min，待液體完全冷卻后置于-20℃分裝保存，避免反復凍融。

二、凝膠電泳

1、制膠及上樣：

1.1、配制分離膠，根據蛋白大小，選擇不同濃度的分離膠（見(jiàn)下表）混勻后注入預先按照好的制膠器中，其上加一薄層異丙醇封膠，室溫水平靜置 30min 至凝固。聚合后，可見(jiàn)在頂層異丙醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線(xiàn)。注意：防止氣泡注入；注膠前加入 TEMED,防止注膠前凝固；注入異丙醇時(shí)需沿玻板一邊緩慢拖動(dòng)加入。

1.2、待分離膠凝固后，傾去其上的異丙醇，以吸水紙吸凈殘余液體，緩緩加入配制好的濃縮膠至玻璃平板夾層， 將樣品梳沿玻板一端緩慢插入夾層的濃縮膠液體中，必要時(shí)，再補加濃縮膠液體充盈剩余空間。室溫水平靜置 30min， 待膠完全聚合，凝膠時(shí)間視溫度而定。注意樣品梳與膠溶液間避免產(chǎn)生氣泡。

1.3、將凝膠固定于電泳裝置上，內槽加滿(mǎn)電泳緩沖液，外槽沒(méi)過(guò)底部 3-5cm 即可。雙手垂直拔出樣品梳。

1.4、用移液槍吸取樣品垂直梳孔上樣。成分很復雜的蛋白質(zhì)混合物需加 100～200μg，而成分較少的樣本只需 1-50μg 蛋白量。對照孔加入蛋白質(zhì)分子量標準品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白 1×Loading Buffer，以防相鄰泳道樣品的擴散。

分離膠濃度的選擇：

2、電泳（采用恒壓）

2.1、接通凝膠電泳儀的電源，先在 80V 下電泳至溴酚藍染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠。（約 30 分鐘）

2.2、提高電壓至 120V，繼續電泳直至溴酚藍到達凝膠底部為止。

三、轉膜

1.1、從玻璃板中取出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序，將其浸泡于轉移緩沖液中。

1.2、取與膠同樣大小的 NC 或 PVDF 膜，NC 膜用轉移緩沖液浸泡 5 分鐘以上待用，PVDF 膜需要先放入甲醇中浸泡5-10 分鐘，再放入轉移緩沖液浸泡。

注意：目的蛋白分子量大于 20kDa 選擇 0.45μm 的NC 膜，小于 20kDa 選擇 0.2μm 的NC 膜或 0.22μm 的PVDF 膜。

1.3、按從負極到正極順序在轉移夾內依次放置預先經(jīng)轉移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、凝膠、膜、三層濾紙、海綿，保證每層之間沒(méi)有氣泡。

1.4、將轉移夾放入預先加滿(mǎn)轉移緩沖液的轉移槽中，膜在正極、膠在負極，整個(gè)轉移槽放置入冰水浴中，按照下表條件進(jìn)行電泳。

注意：事先裁剪濾紙和膜，1 張膜和 6 張濾紙?？磕ひ粋葹V紙可裁剪稍小些，以防與另一側濾紙邊緣連接形成短路。轉膜條件的選擇：

四、封閉

把膜取出后放入合適孵育容器中，加入 5%脫脂奶粉/TBST，室溫搖動(dòng)孵育 1 小時(shí)。

五、抗體孵育

1、一抗孵育：直接將一抗加入封閉液中進(jìn)行適當稀釋?zhuān)覝?2h 或 4℃振搖孵育過(guò)夜；

2、以 TBST 洗膜，5 分鐘 x 4 次；

3、二抗孵育：二抗用 TBST 稀釋?zhuān)覝叵抡駬u孵育 1h；

4、以 TBST 洗膜，5 分鐘 x 4 次。

注意：清洗換液過(guò)程中應避免膜干掉，否則會(huì )產(chǎn)生非特異背景。

六、曝光

1、根據膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，將 ECL 試劑盒中的 A、B 組分按 1：1 的比例混合，配置成發(fā)光檢測工作液。

2、用鑷子取出膜，膜下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余液體，將工作液加到膜上，室溫孵育 1-2min，此步驟可在潔凈保鮮膜上完成。

3、壓片檢測：將膜固定于片夾內，暗室壓片 1 分鐘，立即顯影定影，根據結果調整壓片時(shí)間，或直接分別壓片 30s、1min、3min、5min，然后一起顯影定影觀(guān)察結果。

4、熒光成像儀檢測：將膜放到熒光成像儀內，參考儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測。